毛正初，原名毛本忠，1901年3月2日出生在安徽省六安县除集毛大庄一户大地主家庭。兄弟四人，他排行最后。父母去世后，毛正初得到三哥毛占鳌支持，入私塾读书。1918年由私塾转入六安城内屯卫高小。
1919年五四运动爆发，六安安徽省立第三甲种农业学校、师范讲习所、城关第一高小和屯卫高小等校师生，群情激愤，于5月8日举行示威游行、散发传单和街头演说等活动，并通电声援北京爱国学生。同年8月，六安成立了学生会，大力开展抵制日货斗争，毛正初积极参加六安仇货检查队。他与同学们一起到城关各商店检查、登记和封存仇货，禁止销售。同时带头把自己日用的洋伞、毛巾、洋皂、搪瓷制品等，全部集中到老街门台子，同检查没收的其他日货一起，当众烧毁。
1921年，毛正初考入芜湖安徽省立第二甲种农业学校，开始阅读进步书刊，接受新文化思潮。次年暑假，他和六安进步青年许继慎、杨溥泉、王逸常、宋佛年、胡苏明等，参加了六安人民驱逐县知事骆通的活动，受到安徽军阀马联甲的注意。1923年，他被迫由毛本忠改名毛正初，考入芜湖私立求是中学。1924年，转入安徽省立第五中学。
1925年上海五卅惨案发生后，毛正初和五中学生纷纷走上街头进行宣传，号召芜湖各界人民进行罢工、罢课、罢市，声援上海工人的斗争。毛正初积极参加“三罢”活动，因而受到校方的忌恨，遂以“操作不良”为口实，将他开除学籍。是年秋，毛正初被迫离开芜湖，转入安庆建华中学。
毛正初在芜湖上学时，往返都要乘船经过巢湖。这时，日本帝国主义的小火轮已侵入中国内河航行，他从不搭乘日本轮船。他说，日本轮船进入中国内河，严重侵犯中国的主权，如果我们乘坐他们的船，实际上就是对日本侵略行为的默认。他坚持从自己做起，坚决抵制日本帝国主义的侵略行为。虽然，他一个人的力量很微弱，但他的爱国行为，却表现出一个普通中国人的铮铮铁骨。
1926年秋，毛正初中学毕业。当时，反帝反封建的国民革命运动正在南方兴起，他决心投笔从戎，并如愿在广州考入黄埔军校六期，同年参加中国共产党。1927年，四一二反革命政变后，蒋介石血腥镇压共产党员和工农群众。6月，毛正初受党派遣回六安开展革命活动。同年10月，北伐军第三十三军调离，国民党“清党”委员毛子敬来到六安，白色恐怖开始笼罩六安。根据中共六安特区委员会决定，毛正初在家乡徐集以教书作掩护进行秘密活动。他利用家庭社会关系，经常同长工、佃户们生活在一起，有空就给他们讲太平天国，讲孙中山、列宁领导革命的故事，启发农民的阶级觉悟。在此基础上组织秘密农民协会。这年秋收大忙季节，毛正初发动长工罢耕，以增加工资、改善伙食作为复耕条件。地主们眼看粮食无人收，土地无人种，迫于无奈，只得接受复耕条件。
接着，毛正初发动秘密农民协会会员，联名控诉混进徐集小学、人称“方老虎”的恶霸方觉明，揭露方觉明仗势欺人、吞占学田、学款等罪行。经打入六安县教育会任会长的中共地下党员王少洲裁定，“去职免究”，使不可一世的“方老虎”终于被农民撵出学校。
1928年秋，根据党的指示，毛正初利用社会关系打入徐集民团担任队长，暗中发展有觉悟的士兵徐四等人加入党组织，从22个团丁中，争取了15人信仰党的革命主张，逐步把徐集民团改造为党领导的革命武装，并利用民团武装协助农民协会，打击恶霸地主陈可大、徐少周等。
1929年，徐集发生旱灾，麦收时，保董、人称“小太岁”的曾炳恒、大地主陈可大、土豪毛占魁等密谋按人口每人增派3斤“人头积谷”，妄图营私舞弊。毛正初发动全乡人民开展反“人头积谷”斗争，并在地主集会时，带领八名团丁(均系中共党员)闯入会场，严词指斥说：“饥荒严重，如果你们再均派新税，就会逼着人民造反，那时砍掉你们的脑袋，我民团万难负责。”使曾炳恒、陈可大、毛占魁等人增派“人头积谷”的阴谋破产。这次斗争给千家万户农民免除了疾苦，徐集人民称赞毛正初是敢在“太岁头上动土”、“老虎屁股拔毛”的英雄。
斗争的胜利，不仅树立了毛正初的威望，而且更有利于深入开展革命运动。当时，南岳庙、商家庙、江店子、新安集、桥头集、火星庙、郭子店、单王、顺河、二天门等地的秘密农民协会闻风而动，声势愈益壮大。为了进一步发动群众，毛正初用通俗的语言宣传说：“条牛石种人种田，地主老财坐收钱。穷人光蛋跟党走，打倒豪绅好过年。”这些语言深深地打动了农民群众的心，群众斗争的积极性越来越高涨。
毛正初的同胞大哥毛占魁，由于本质反动，对其弟的日常行动早有怀疑。一次，他乘空偷入毛正初卧室，发现私藏的油印机和印刷后没有烧尽的“铲除封建……”、“反帝大同盟……”等字样的蜡纸，便向六安警备营告密，说毛正初明干民团，暗干共产党。警备营派联防大队长朱九石带人到徐集逮捕毛正初。朱九石与毛正初曾有交往，便私下通知毛正初出走。毛正初离开前，召开民团内共产党组织紧急会议，将民团内的秘密组织和兵运工作，改由共产党员徐四负责，定期在徐集刘家药店碰头联络。徐集民团队长改由六安县联防大队长朱九石接任。毛正初遂潜入农村等待民团起义。
1929年11月7日，六安爆发独山武装起义，皖西各地纷纷响应，形成了武装斗争的新高潮。在中共地下党员许百川、李野樵、姜镜堂、詹雨生等密切配合下，毛正初在徐集毛大庄家中，召集有关人员开会，讨论和部署徐集民团起义。中共六安中心县委常委、宣传部长周狷之参加了这次会议，会议决定于11月25日夜举行起义，由周狷之率领游击队80余人枪到徐集支援。
是日晚，游击队分散潜入徐集街上。民团内共产党组织于起义前监视了七名不可靠团丁，并卸除了他们的枪栓。起义规定击掌为号，实行里应外合。10点钟后，毛正初率领突击队包围了民团队部，在起义团丁的接应下，一举占领民团队部。朱九石企图持枪反抗，被当场击毙。徐集民团22人枪的起义，获得圆满成功。
徐集民团起义后，被编为六安四区红军游击大队(又称河西红军游击大队)，毛正初任大队长，丁香墀任秘书。同时成立六安四区革命委员会。毛正初带领红军游击队在徐集街镇上逮捕了方定山等三户恶霸地主，将魏大可等四户大地主的财产分给贫苦农民，并策应支援李野樵领导的江店民团起义。然后一同开至王桥子，创建河西革命根据地。从此，揭开了六安河西农民武装起义的序幕。
1930年元月，这支年轻的游击大队在徐集附近与地主徐守富为首的反动“红学”500余人作战，击毙了“红学”首领曾广志、李显和等，打击了反动会道门的嚣张气焰，鼓舞了群众的革命斗志。由于徐集距六安仅30华里，城里又常驻重兵，河西红军游击大队便在极端艰苦的条件下，辗转于江店、南岳庙、郭店子、丁集一带，进行游击活动。
2月，游击大队发展到200余人枪。3月，国民党安徽省警备第二团团长杨松山，对游击大队采取“清剿”与“招抚”政策，妄图以委任毛正初为警备二团团附为条件，消灭河西红军游击大队。在敌人强大的武装压力和糖衣炮弹面前。毛正初大义凛然，毫不动摇。杨松山阴谋破产，便下令“清剿”。由于双方力量悬殊，游击大队受到挫折，少数战士在困难环境中产生了动摇情绪，形势十分险恶。
1930年春，毛正初率领游击大队，采取灵活的游击战术，先后攻破南岳庙侯家圩敌人，俘获100余人枪，击溃江店民团，缴枪十余支；五次袭击徐集杨晓山民团；镇压了劣绅侯园龙、特务方正文、土豪朱建亭、反水土匪杨三货郎、樊六、刘大侉子、曹祥会等；并亲自带领游击队战士，搜捕破坏徐集民团起义的罪魁毛占魁，吓得毛占魁丧魂失魄，逃往河东白区。接着，毛正初率领游击大队转战徐集、金寨、麻埠、南溪、黄安，纵横百余里，大小数十战，打通了河西与鄂豫根据地的道路，使各个根据地的游击武装，互相呼应。经过艰苦的战争，毛正初终于白手起家创造了以徐集为中心的六安河西革命根据地。
1931年2月下旬，游击大队发展为游击师，毛正初任师长，袁晓峰任政治委员。不久，游击师改称赤卫军总司令部，毛正初任司令，张汉卿任政治委员。下辖四个团，共3100余人，枪700余支。第一次反“围剿”胜利后，中共六安县委根据中共皖西北特委指示，利用毛正初在河西创造根据地的有利条件，决定于5月3日，在河西新安集再一次举行武装起义，并派毛正初任总指挥。
毛正初接受任务后，决定以蔡家庄为指挥所，预先派人混入新安集埋伏，起义时，断绝新安集与六安的联系。5月2日夜，毛正初集结赤卫军5000人，分三路包围新安民团团部——大神庙。3日拂晓，毛正初率部开始进攻，激战两小时，眼看民团团长徐集章即将被俘，不料他的女婿杨晓山由西桥头集带兵驰援，拼死把他救出重围，拽着马尾巴浮过淠河，才算保住性命。
新安暴动胜利后，毛正初率领起义大军，以摧枯拉朽之势，攻克火星庙、郭店子、单家埠、王集子、二天门、陈家楼(陈玉堂旱圩子)，消灭和打垮丁锡庭、丁大侉子、陈玉堂等地主武装，使上自西两河口，下至马头集的淠河西岸广大地区，连成一片完整的革命根据地。
是年5月，在独山镇正式成立六安县苏维埃政府和县赤卫军总指挥部，书记鲍益三，主席王义中(余道江)，毛正初任赤卫军总指挥兼县独立团团长，统率六个赤卫军团，计25000余人枪。同年夏，毛正初被任命为中共皖西北特委军事委员会常委。
毛正初领导河西农民大起义的声威，使国民党安徽省政府主席陈调元坐卧不安，他首先派遣岳盛警备旅一个团，向徐集进犯。结果，该团前进到距徐集五里处的大岭岗，即被赤卫军设伏击溃。陈调元第二次调派国民党第五十六师、警备二旅、独立旅及地方民团等共1000余人枪，由莲花巷、窑岗咀渡河，分路向徐集和河西各地进犯，妄图扑灭六安河西已经燃烧起来的革命烈火。毛正初集中独立团、赤卫军4000余人枪，采取“选好地形，迂回埋伏”；依靠群众，诱敌深入；集中优势，歼敌一路；避强打弱，各个击破”的战术，把入侵之敌装在河西人民的“大口袋”里，一口一口地吃掉。据不完全统计，这两次反“围剿”战斗，先后在武陟山、除集南岗头等战斗中，生俘国民党正规军393人，缴枪391支、迫击炮一门、机枪一挺、马50匹、子弹50箱，击毙和淹死敌人约200余人，使入侵之敌狼狈溃逃至淠河东岸。
国民党反动派不甘心失败，在派兵侵犯河西苏区的同时，又把河东从单家埠至马头集沿线划为六段，派袁敬失、杨马虎子等地主土豪分任段长，对河西苏区进行严密的经济封锁，禁止河西输入食盐和输出农产品，妄图在经济上窒息河西革命根据地。
为了粉碎敌人在河东的经济封锁，毛正初详尽地分析了当时双方军事实力，为出击作战做了充分的准备工作，然后，他亲自率领三个团9000余人枪，用四倍于敌的优势兵力，突然渡河出击，一举突破敌人武装封锁线。接着，采用分路穿插，迂回包围的战术，把敌人分割包围在六个据点之中，各个击破。经过四个小时的激烈战斗，彻底摧毁了敌人号称“铜墙铁壁”的40里经济封锁线。这次战斗，共毙伤敌700余人，俘敌800余人，解决了食盐供应和农产品外销等问题。这是保卫河西苏区经济建设的关键性的一次战斗。
出击河东胜利不久，国民党反动派又煽动寿县、霍邱、颖上和六安边境的大刀会、红缨枪会、红枪会等封建会道门1800余人，号称万人，进犯河西革命根据地，破坏苏区人民的大秋收。反动会首赵厚培，打着黑狗牙边会旗，带领正阳关骨干会众600余人，每人胸前画着横三竖三、红红绿绿的符咒，由马头集过河，向丁集苏区进犯。他们狂妄地叫嚣说：“先打开河西赤区大门，再长驱直入鄂豫皖根据地。”发疯似地向苏区压来。
毛正初率领县独立团，早在郭店子一带严阵以待。面对这群疯狂的会匪，他深知这是愚民上当受骗。于是，采用“避过敌人前锋，诱敌钻进口袋，消灭会首，狠打屁股”的战术。战斗开始后，毛正初先发制人，举枪击毙会首赵厚培，使那些装在“口袋”里的会众不战自乱。结果，毙伤会众500余人，生俘600余人，缴获镖枪1200余支，使溃残会首二老桂等龟缩到河东，再也不敢蠢动。
同年秋，毛正初集中兵力，决心拔掉河西敌人残存的唯一据点——清凉寺陈玉堂的水圩子(陈后圩子)。陈玉堂是破坏河西革命最反动、最顽固的刽子手。他龟缩在圩内，一面训练圩勇，一面与外地反动武装通风联络，甘作入侵苏区的内应。河西所有的反动残余分子，如杨思培、赵四狗皮、撮嘴小老八等，都逃亡在他的圩内。他们狼狈为奸，准备同河西苏维埃政府顽抗到底。围攻陈后圩子的战斗，历时20余天。由于圩坚沟深，陈玉堂等一小撮反动余孽仍无动于衷，天天在圩内喝酒唱戏，寻欢作乐。在当地群众的积极支援下，毛正初和战士一起，夜以继日地搭沟排水。最后，圩沟里的水放干排尽，圩内的反动武装才开始惊慌起来。但是，他们不甘心缴械投降，阴谋用开门诈降的诡计将毛正初骗入圩内，加以杀害。毛正初觉察到敌人的奸计，和赤卫军团长李野樵商定后，便趁入圩谈判时机，指挥战士一齐冲入圩内，打得敌人措手不及，歼灭了圩内全部的顽固分子。这次战斗，计缴获土枪100支、钢枪200余支、大米100余石，以及其他大量金银财物等。彻底肃清了河西革命根据地内的反动据点。
1931年秋，毛正初受“左”倾机会主义路线迫害，被枉加“改组派”罪名，遭杀害于麻埠文昌宫。