上海四一二政变和长沙马日事变发生之后，贺龙与贺锦斋等一起分析了政治形势，经过反复考虑，决定把部队带回武汉，并将从湖南某地转移出来的一大批农民协会干部和汉口工农革命武装编入部队，扩编为国民革命军第二十军。１９２７年６月，年仅２５岁的贺锦斋被任命为第一师师长，成为当时国民革命军中最年轻的师长之一。７月下旬，他率领第一师随贺龙开赴南昌。
在举世闻名的南昌起义中，按照前敌委员会和第二十军军部的部署，贺锦斋将全师布置在中华旅社和旋宫饭馆一带，担负主攻敌第五路军总指挥部的任务。战斗打响后，因守敌已有准备，战斗打得非常艰苦。他冒着敌人的猛烈炮火，爬上楼房屋顶，指挥部队架起云梯，占领制高点——鼓楼。然后居高临下，用机枪火力将敌人压在指挥部内，与迂回到敌背后的第二师第五团前后夹击，经过３小时的激战，全歼守敌，促进了整个战斗的胜利。
在随起义部队南征途中，贺锦斋光荣地加入了中国共产党。９月下旬至１０月上旬，起义部队在广东潮汕地区因遭数倍敌军的夹击，严重受挫。他只带一名警卫营长突出了重围。
南昌起义军余部在潮汕失败后，贺锦斋于１０月底辗转到达上海，设法与党组织接上了关系。形势逆转，革命的挫折，使他义愤填膺。于是，他挥笔填了《浪淘沙》一首：
仰望蓝天，与水相连，
两岸花柳更鲜妍。
可惜一片好风景，
被匪摧残。
蒋匪太凶顽，作恶多端，
屠杀工农血不干。
我辈应伸医国手，
重整河山。
这年冬，贺锦斋根据党的指示，从上海经武汉回到荆江地区监利、石首一带，从事组建游击武装的斗争。他到达荆江后，立即在湖北省委所派的黄鳌等同志的领导下，组织了一支有五六十人的游击队伍。
一天，石首城边的码头上停靠着一艘有武装押运的轮船。经查明，这艘船是运送武器的，老板叫李占轩，是国民党的一个大恶棍。贺锦斋扮成穿戴阔气的绅士，带着几个“随从”，大摇大摆地来到码头上，十分傲慢地对哨兵说，“快去禀报一声，我要拜会李老板！”听到哨兵禀报的李占轩刚走下扶梯，就被贺锦斋一把抓住，用短枪顶着腰说：“跟我走，不许声张！”这时，“随从”们也下了哨兵的枪。李占轩只好乖乖地跟着贺锦斋来到游击队部，按照他的命令写条子，叫船上的人把武器及其它物资全部送来。