皖南事变发生后，中共中央同国民党顽固派展开了针锋相对的斗争。１９４１年１月２０日，毛泽东以中共中央军委发言人名义发表谈话，揭露国民党当局的反共阴谋，抗议其武装袭击新四军的暴行，要求国民党当局以大局为重，取消１月１７日的反动命令，惩办祸首，释放叶挺，废止国民党一党专政，实行民主政治。华北、华中各抗日根据地军民也纷纷集会，强烈声讨国民党顽固派的罪恶行径。八路军、新四军做好了随时反击国民党顽固派武装进攻的准备。同日，中共中央军委发布重建新四军军部的命令，任命陈毅为代理军长，刘少奇为政治委员，张云逸为副军长，赖传珠为参谋长，邓子恢为政治部主任。１月２５日，新四军新军部在苏北盐城成立，随即将全军整编为七个师和一个独立旅：第一师师长粟裕、政治委员刘炎；第二师师长张云逸（兼）、政治委员郑位三；第三师师长兼政治委员黄克诚；第四师师长兼政治委员彭雪枫；第五师师长兼政治委员李先念；第六师师长兼政治委员谭震林；第七师师长张鼎丞、政治委员曾希圣；独立旅旅长梁兴初、政治委员罗华生。全军共９万余人，继续坚持长江南北的抗战。
中共中央高瞻远瞩、总揽全局，提出在政治上取攻势、在军事上取守势，坚决击退国民党顽固派第二次反共高潮的正确方针。周恩来领导南方局在重庆同国民党顽固派展开了坚决斗争，从政治上和宣传上进行了猛烈反击。１月１７日，周恩来为皖南事变向国民党谈判代表张冲提出质问和抗议，并打电话怒斥何应钦说：“你们的行为，使亲者痛，仇者快，你们做了日寇想做而做不到的事。”当《新华日报》关于揭露事变真相的报道和社论被国民党当局扣压后，周恩来立即题写“为江南死国难者志哀！”“千古奇冤，江南一叶；同室操戈，相煎何急？！”的题词，登在被扣稿件的位置上，对国民党顽固派的反动行径进行了有力的声讨。周恩来还领导南方局通过召开座谈会、个别谈话、散发传单等方式，向各界人士公布皖南事变的真相，揭露国民党顽固派的反共面目。
共产党的正义自卫立场，得到各界人士、民主党派的同情和支持。宋庆龄、柳亚子、何香凝、陈友仁等国民党左派人士，为皖南事变在香港发起抗议活动。宋庆龄等致函致电蒋介石及国民党中央，谴责“剿共”内战违背民心，已“引起国人惶惑，招致友邦疑虑”；要求他们“慎守总理遗训”，“撤销剿共部署，解决联共方案，发展各种抗日实力，保障各种抗日党派”（宋庆龄、柳亚子、何香凝、彭泽民致“蒋总裁暨中央执行委员监察委员诸同志”函，１９４１年１月１２日）。各民主党派对国民党顽固派的反共行动也表示不满和愤慨。章伯钧等同周恩来等交换意见，准备成立民主联合会，团结各民主党派、无党派人士同中共合作，共同推进民主改革和反对内战。在国民党内部，也有很多人不赞成蒋介石打内战。孙科对时局表示忧虑。张治中向蒋介石上万言书，痛陈对中共问题的处理失策。海外华侨也反对分裂。华侨领袖陈嘉庚致电国民参政会，呼吁团结，反对蒋介石的倒行逆施。在国际上，国民党顽固派的反共高潮，不仅为苏联所反对，美、英等国也表示不满。２月中旬，美国政府正式向蒋介石声明：美国在国共纠纷未解决前，无法大量援华，中美间的经济、财政等各种问题不可能有任何进展。
国民党当局在政治上陷于空前孤立的形势下，不得不收敛其反共活动。１９４１年２月，蒋介石加紧筹备于３月１日召开的国民参政会第二届会议，企图通过邀请中共参政员出席以粉饰门面，欺骗舆论。中共参政员拒绝出席这次会议。３月２日，根据中共中央的指示，在重庆的中共参政员董必武、邓颖超致函国民参政会，提出承认中共及民主党派和陕甘宁边区的合法地位、释放皖南事变中所有被捕干部战士等十二条要求，作为出席会议的条件。共产党的坚决态度，赢得中间势力的拥护和支持，迫使蒋介石在第二届参政会上表示“以后再亦决无剿共的军事”。３月８日，国民参政会仍选举董必武为驻会参政员。３月１４日，蒋介石约请周恩来面谈，答应提前解决国共间的若干问题。至此，第二次反共高潮被打退。
国民党顽固派制造皖南事变，并没有达到打击共产党、消灭新四军的目的，反而惊醒和教育了对国民党抱有幻想的人们，孤立了自己。中国共产党在这场斗争中的坚定立场和维护抗战大局的态度，赢得了多方面的同情，扩大了在群众中的影响，提高了在全国的政治地位。
皖南事变的恰当处理，再次证明了中共中央对国民党顽固派采取的策略方针的正确性。这次斗争的经验说明：第一，“任何的人民革命力量如果要避免为蒋介石所消灭，并迫使他承认这种力量的存在，除了对于他的反革命政策作针锋相对的斗争，便无他路可循”。第二，在日本侵略者深入国土的情况下，中日民族间的矛盾依然是基本的，国内阶级间的矛盾依然处在从属的地位。因此，必须正确处理民族矛盾和阶级矛盾的关系；对国民党顽固派反共政策的斗争，必须坚持有理、有利、有节的原则。这种斗争的目的是保卫人民抗日力量，争取中间派，制止国民党顽固派的分裂、投降和发动内战的阴谋活动，坚持抗日民族统一战线。第三，在同国民党顽固派的斗争中，在不损害党和人民的根本利益的原则下，作适当的让步是必要的。正是由于在“佳电”中的适当让步，使党在皖南事变后取得了转入政治反攻的主动地位，并使中间派了解共产党的以斗争求团结的政策，从而取得他们的同情。
新四军皖南部队的严重损失，主要是国民党顽固派的反共政策造成的。从共产党内来说，则与中共中央东南局书记、新四军主要领导人项英的错误有关。应当肯定，项英在领导新四军的工作中有着不可抹煞的功绩。他和叶挺、陈毅等人一起，在短时期内把极为分散的南方八省红军游击队进行集中整编，组织部队奔赴敌后开展游击战争，积极进行部队建设，使新四军不断发展，并领导了建立抗日根据地的工作。但他对统一战线中的独立自主原则认识不足，在敌占区未能放手发动群众，对中共中央“向北发展，向敌后发展”的正确方针理解不够，贯彻措施不力。他存在着以皖南为中心，待日军向浙赣路进攻时向南发展，恢复原南方根据地的不切实际的思想。１９４０年１０月以后，当国民党顽固派进攻新四军的迹象已经十分明显的时候，项英对皖南部队的北移，迟疑犹豫，结果丧失迅速东进或北移的有利时机。在部队北移受阻后，又指挥失当，因而未能粉碎国民党的围歼，致使新四军在皖南事变中遭受严重损失。
１９４１年５月２０日，根据中共中央决定，东南局与中原局合并，改称中共中央华中局，同时成立新四军军分会，刘少奇为华中局书记兼军分会书记，华中局委员为饶漱石、陈毅、曾山，新四军军分会委员为陈毅、饶漱石、赖传珠、邓子恢。在华中局领导下，先后成立了江南、苏中、淮南、淮北、苏北、鄂豫皖、浙东、皖江、苏浙等区党委。１９４２年２月１５日至３月５日，华中局召开第一次扩大会议，刘少奇作了华中三年工作的基本总结及今后任务等问题的报告。他强调必须继续坚持华中敌后抗战，巩固各抗日根据地，加强和聚集力量，以便在适当时机反攻敌人，争取中国抗战的最后胜利和中国人民的彻底解放。中共中央华中局成立后，华中敌后抗战出现了新的局面。
